摘要

我们旨在检查高尔基体蛋白 GOLPH3 是否会影响胶质瘤细胞来源的外泌体的分泌。通过超离心从 U251 和 U87 细胞培养物的上清液中提取外泌体，并通过透射电子显微镜 (TEM)、马尔文分析仪和蛋白质印迹进行鉴定。通过测量总蛋白质水平和多囊泡体 (MVB)（外泌体的来源）的数量来检查外泌体的数量。通过高通量测序分析外泌体 miRNA，然后进行 GO 和 KEGG 分析，并通过 qRT-PCR 进行验证。 GOLPH3 不会影响外泌体的总蛋白水平和 MVB 的数量。然而，我们在载体和GOLPH3过表达组之间的外泌体中发现了149个差异表达的miRNA，其中14个miRNA仅在GOLPH3过表达细胞中进行了检测。这些miRNAs的预测靶基因具有结合和催化活性的功能，在癌症中的内吞作用、RNA转运、甲状腺激素信号传导和miRNAs通路中富集。 GOLPH3 不影响外泌体的数量，而是促进外泌体中 miRNA 的表达，这可能在 GOLPH3 对胶质瘤发展的促进作用中发挥一定的作用。

讨论

几十年来，几乎所有体液中都发现了外泌体，包括血液、尿液、唾液、脑脊液和腹水（Street 等人，2017 年）。这些具有特定 miRNA、蛋白质和脂质特征的外泌体可以作为其亲代细胞的“指纹”或“签名”，反映它们的细胞起源和相应的生理条件。因此，外泌体及其细胞或条件特异性货物可以深入了解细胞过程并用作许多疾病的生物标志物（Zhang et al. 2019）。

因为 GOLPH3 在囊泡从高尔基体出口到质膜中发挥重要作用（Kuna 和 Field 2019），我们推断 GOLPH3 可能在外泌体分泌中发挥作用。不幸的是，我们发现 GOLPH3 不能影响外泌体的数量。此外，格罗斯等人。表明，在果蝇和人类细胞中，wnts 分泌在外泌体中，后者在其表面携带 wnts 以诱导靶细胞中的 wnt 信号活动（Gross 等人，2012 年）。然而，虽然我们发现 wnt2b 可以分泌到外泌体中，但在 GOLPH3 过表达后，wnt2b 的水平以及内切和外切 GOLPH3 的水平没有变化，表明 GOLPH3 对 wnt2b 分泌的促进作用（Lu et al. 2018) 不是作为外泌体进行的。

miRNA作为重要的非编码小RNA，参与生物过程的转录后调控。 miRNA 的表达谱在正常组织和疾病组织中差异很大，并显示出生理学特异性特征（Heinzelmann 等人，2011 年）。累积证据表明，miRNA 可用作细胞和外泌体中有价值的病理和治疗生物标志物（Bekris 和 Leverenz 2015；Lei 等人 2017）。高通量小RNA测序技术为探索外泌体中的miRNA提供了便利，并为不同环境下的外泌体生成了大量数据。对这些数据的比较研究有助于探索外泌体中的 miRNA 生物标志物，并了解它们在受体细胞中由外泌体介导的调节作用。有趣的是，通过进行外泌体高通量小 RNA 测序，我们发现 GOLPH3 过表达组与其载体对照之间有 149 个差异表达的成熟 miRNA，其中许多，如 miR-21 和 miR-182，在GBM（Huang 等人，2018b；Wang 等人，2012 年；Wang 等人，2019 年；Zang 等人，2018 年）。

在上述 miRNA 中，研究最多的 GBM 上调之一是 miR-21（Masoudi 等人，2018 年）。据报道，miR-21 的下调会降低 GBM 细胞系的致癌潜力（Krichevsky 和 ​​Gabriely 2009）并减少裸鼠的肿瘤生长（Gaur 等人 2011；Zhou 等人 2010）。 miR-21 众所周知的靶点是肿瘤抑制因子，如 PTEN、RECK 和 PDCD4，miR-21 通过它们促进 GBM 增殖（Gaur 等人 2011；Shi 等人 2015；Zhou 等人 2010）。 miR-21 被敲低的细胞的转录分析揭示了与 DNA 损伤反应、细胞周期停滞调节剂和细胞凋亡正调节剂相关的基因表达的变化（Gabriely 等人，2008 年）。总之，miR-21 可能是 GBM 中外泌体治疗开发的一个特别引人入胜的主题。此外，据报道 miR-376c-3p 可促进或抑制许多人类癌症的进展，例如胃癌、肝细胞癌和神经母细胞瘤（Bhavsar 等人，2018 年；Liu 等人，2019 年；Wang 等人，2018 年）。由于 miR-376c-3p 是 GOLPH3 过表达后外泌体中增加最多的 miRNA，因此检查 miR-376c-3p 在神经胶质瘤进展中的作用将很有趣。

KEGG通路富集分析显示，这些miRNAs靶基因主要富集在T细胞分化、趋化因子信号通路、细胞粘附分子、apelin信号通路、内吞作用和RNA转运等方面。 更有趣的是，我们发现一些miRNAs，如miR -1288、miR-299和miR-1292仅存在于GOLPH3过表达细胞中，表明它们可能在胶质瘤细胞生物学功能中发挥作用。许多论文报道外泌体miRNA在肿瘤进展中发挥重要作用（Huang et al. 2018b; Zeng et al. 2017），并且外泌体可以通过形成转移前的生态位来促进癌细胞在转移部位的存活（Liang et al. 2017）。 2016；刘和曹 2016)；因此，测试这些 miRNA 在神经胶质瘤细胞生长和迁移/侵袭中的功能将会很有趣。

总之，GOLPH3不促进外泌体的分泌量，但影响GBM细胞来源的外泌体中miRNA的表达谱。由于外泌体中差异表达miRNA的靶基因参与了T细胞分化、趋化因子信号通路、细胞粘附分子、apelin信号通路、内吞作用和RNA转运等，我们推断它们将在胶质瘤中发挥一定作用。